RNA roa tady (dsRNA) ELISA KIT

Ity kitapo ity dia Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) miaraka amin'ny rafitra biotin-Streptavidin, ho an'ny fandrefesana ny dsRNA amin'ny halavany mihoatra ny 60 base pairs(bp), na inona na inona filaharana.Ny takelaka dia efa nofonosina antibody anti-dsRNA.Ny dsRNA misy ao amin'ny santionany dia ampiana ary mifatotra amin'ny antibiôsy mipetaka amin'ny lavadrano.Ary avy eo dia ampiana antibody anti-dsRNA biotinylated ary mifatotra amin'ny dsRNA ao amin'ny santionany.Aorian'ny fanasana dia ampiana ny HRP-Streptavidin ary mifatotra amin'ny antibody anti-dsRNA Biotinylated.Taorian'ny incubation tsy mifatotra HRP-Streptavidin dia voasasa.Avy eo, ny vahaolana substrate TMB dia ampiana sy atosiky ny HRP mba hamokatra vokatra miloko manga izay niova ho mavo taorian'ny nasiany vahaolana fiatoana asidra.Ny hakitroky ny mavo dia mifandanja amin'ny habetsahan'ny dsRNA voasambotra ao anaty takelaka.Ny absorbance dia refesina amin'ny 450 nm.

Fampiharana

Ity kitapo ity dia natao ho an'ny fandrefesana fatra ny dsRNA sisa.

Kit singa

Fitehirizana sy fahamarinan-toerana

1. Ho an'ny kitapo tsy ampiasaina: Ny kitapo manontolo dia azo tehirizina amin'ny 2 ~ 8 ℃ amin'ny fiainana talantalana.Tokony hohalavirina ny hazavana mafy mba hisian'ny fitoniana fitahirizana.

2. Ho an'ny kitapo efa nampiasaina: Raha vao misokatra ny microplate, azafady, sarony amin'ny sealer plate ny lavadrano tsy ampiasaina ary avereno any amin'ny kitapo foil misy ny fonosana desiccant, asio zipo ny kitapo foil ary avereno any amin'ny 2 ~ 8 ℃ haingana araka izay azo atao aorian'ny fampiasana.Ny reagents hafa dia tokony haverina amin'ny 2 ~ 8 ℃ haingana araka izay azo atao aorian'ny fampiasana.

Fitaovana ilaina fa tsy omena

1. Microplate mpamaky amin'ny 450±10nm sivana (tsara kokoa raha afaka mamantatra amin'ny 450 sy 650 nm halavan'ny onjam).

2. Microplate shaker.

3. Torohevitra tsy misy RNase sy fantsona centrifuge.

Operation Flowchart

Alohan'ny hanombohanao

1. Ento amin'ny mari-pana (18-25 ℃) ny singa rehetra ao amin'ny kitapo alohan'ny hampiasana azy.Raha toa ka tsy ho lany indray mandeha ilay kitapo, dia alao fotsiny ny tady sy ny réagents ho an'ny fanandramana ankehitriny, ary avelao ny tady sy reagents sisa amin'ny fepetra takiana.

2. Fanasan-damba: arotsaho ny 40mL amin'ny buffer fanasan-damba 20 × mivondrona miaraka amin'ny 760mL amin'ny rano deionized na distilled mba hanomanana 800mL amin'ny 1x buffer fanasan-damba.

3. Manara-penitra: manodinkodina vetivety na manodina ny vahaolana tahiry alohan'ny hampiasana azy.Ny fifantohana amin'ny fenitra efatra omena dia 5ng/μL.Ho an'ny fenitry ny UTP sy ny pUTP dsRNA, azafady levona ny vahaolana tahiry ho 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL miaraka amin'ny buffer STE mba hisintonana ny curve mahazatra.Ho an'ny fenitry ny N1-Me-pUTP dsRNA, azafady levona ny vahaolana tahiry ho 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL miaraka amin'ny buffer STE mba hisintonana ny curve mahazatra.Ho an'ny fenitra 5-OMe-UTP dsRNA, azafady levona ny vahaolana tahiry amin'ny 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL miaraka amin'ny buffer STE mba hisintonana ny curve mahazatra.Manoro hevitra izahay fa ny fenitra dia azo levona toy ny tabilao manaraka:

4. Antibody fitiliana biotinylated sy vahaolana miasa HRP-streptavidin: manodinkodina vetivety na manodina ny vahaolana tahiry alohan'ny hampiasana azy.Alefaso izy ireo amin'ny fifantohana miasa amin'ny buffer dilution.

5. TMB substate: aspirate ny fatra ilaina amin'ny vahaolana amin'ny toro-hevitra sterilized ary aza ariana ao anaty vial indray ny vahaolana sisa.TMB substate dia saro-pady amin'ny hazavana, aza apetaho amin'ny hazavana maharitra ny substrate TMB.

Mampiasa protocole

1. Farito ny isan'ny tsipika ilaina amin'ny fitiliana.Ampidiro ao amin'ny frame ny tsipika ampiasaina.Ny takelaka sisa tavela izay tsy ampiasaina amin'ity fitsapana ity dia tokony haverina ao anaty kitapo miaraka amin'ny desiccant.Akatona mafy ny kitapo mba hitehirizana ao anaty vata fampangatsiahana.

2. Ampio 100μL tsirairay ny dilution ny fenitra, banga ary santionany ao amin'ny lavadrano mety.Sarony amin'ny sealer takelaka.Atsofohy mandritra ny 1 ora amin'ny mari-pana amin'ny efitra fihovitrovitra amin'ny 500rpm.Ny santionany dia tokony ho levona amin'ny STE buffer amin'ny fifantohana sahaza ho an'ny fitiliana marina.

3. Dingan'ny fanasan-damba: Atsipazo ny vahaolana ary sasao amin'ny buffer fanasan-damba 250μL isaky ny fantsakana ary avelao hijanona mandritra ny 30s.Esory tanteraka amin'ny alàlan'ny fametahana ny takelaka amin'ny taratasy misoroka.Sasao in-4 tanteraka.

4. Ampio 100μL ny biotinylated detection antibody vahaolana miasa ao anaty lavadrano tsirairay.Sarony amin'ny sealer takelaka.Atsofohy mandritra ny 1 ora amin'ny mari-pana amin'ny efitra fihovitrovitra amin'ny 500rpm.

5. Avereno ny dingana fanasana.

6. Ampio vahaolana miasa HRP-streptavidin 100μL ao anaty lavadrano tsirairay.Sarony amin'ny sealer takelaka.Atsofohy mandritra ny 30 minitra amin'ny mari-pana amin'ny efitra fihovitrovitra amin'ny 500rpm.

7. Avereno indray ny dingana fanasana.

8. Ampio 100μL ny TMB substrate solution ao anaty lavadrano tsirairay.Sarony amin'ny sealer takelaka.Atsofohy mandritra ny 30 minitra amin'ny RT Protect amin'ny hazavana.Hivadika manga ny ranon-javatra amin'ny fanampiana ny vahaolana substrate.

9. Ampio 50μL ny vahaolana fijanonana ao anaty lavaka fantsakana tsirairay.Ny ranon-javatra dia hivadika mavo amin'ny fanampiana ny vahaolana stop.Avy eo dia mandehana ny mpamaky microplate ary manaova fandrefesana amin'ny 450nm avy hatrany.

Kajy ny vokatra

1. Salanisa ny vakiteny dika mitovy ho an'ny fenitra tsirairay, ny fanaraha-maso ary ny santionany ary esory ny salan'isan'ny optika aotra mahazatra.Manangana curve manara-penitra misy absorbance amin'ny axis mitsangana (Y) ary ny fifantohana dsRNA amin'ny axe horizontaly (X).

2. Amporisihina ny hanao ny kajy amin'ny rindrankajy miompana amin'ny curve mifototra amin'ny ordinatera toy ny curve expert 1.3 na ELISA Calc amin'ny modely 5 na 4 tsy mifanentana amin'ny tsipika.

Fampisehoana

1. Fahatsapana:

fetra ambany indrindra amin'ny fahitana: ≤ 0.001pg/μL (ho an'ny UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (ho an'ny 5-OMe-UTP-dsRNA).

fetra ambany kokoa: 0,0156 pg / μL (ho an'ny UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg / μL (ho an'ny N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg / μL (ho an'ny 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Precision: CV an'ny Intra-Assay ≤10%, CV an'ny Inter-Assay ≤10%

3. Famerenana: 80%~120%

4.Linearity: 0.0156-0.5pg/μL(forUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(forN1-Me-pUTP dsRNA),0.0625-1pg/μL(ho an'ny 5-OMe-UTP-dsRNA).

fiheverana

1. TMB fanehoan-kevitra mari-pana sy ny fotoana dia manakiana, azafady fehezo araka ny toromarika hentitra.

2. Mba hahazoana ny reproducibility sy ny fahatsapan-tena tsara, dia ilaina ny manasa araka ny tokony ho izy ny takelaka mba hanesorana ireo reagents tsy mihetsiketsika be loatra.

3. Ny reagents rehetra dia tokony hifangaro tsara alohan'ny hampiasana ary hisorohana ny bumbles mandritra ny santionany na ny fanampim-panafody.

4. Raha misy kristaly miforona ao anaty savony fanasan-damba (20x), mafana hatramin'ny 37 ℃ ary afangaro moramora mandra-pahalevon'ny kristaly.

5. Halaviro ny santionany misy Sodium Azide (NaN3), satria mety hanimba ny asan'ny HRP ka mahatonga ny fanombanana ny habetsahan'ny dsRNA.

6. Fadio ny fandotoana RNase mandritra ny fitiliana.

7. Ny santionany / santionany, ny antibody detection ary ny SA-HRP dia azo atao amin'ny RT tsy misy fihozongozonana, saingy mety hiteraka fihenam-bidy indray mandeha izany.Amin'ity tranga ity, manoro hevitra izahay fa ny fenitra UTP sy pUTP dsRNA dia tokony ho levona avy amin'ny 2pg / μL, ny fenitra N1-Me-pUTP dsRNA dia tokony ho levona amin'ny 4pg / μL ary ny fenitra 5-OMe-UTP dsRNA dia tokony ho levona amin'ny 8pg / μL.Ankoatra izany, incubate HRP-streptavidin vahaolana miasa ho an'ny 60min amin'ny mari-pana.Aza mampiasa vilia fanosotra, satria mety hiteraka voka-dratsy tsy marina.

Vokatra mahazatra

1. Data curve mahazatra

2. Kajy curve mahazatra

3. Liner detection range: 0.0312- 1pg/μL