mRNA Cap2'-O-Methyltransferase
Ny mRNA Cap 2'-O-methyltransferase dia avy amin'ny karazana E. coli recombinant izay mitondra ny fototarazo ho an'ny vaccinia mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase.Ity enzyme ity dia manampy vondrona methyl amin'ny toeran'ny 2'-O amin'ny nucleotide voalohany mifanakaiky amin'ny rafitry ny cap eo amin'ny 5' faran'ny RNA. -0) miteraka rafitra cap- 1.
Ny rafitra Cap1 dia afaka mampitombo ny fahombiazan'ny fandikan-teny, manatsara ny fanehoana mRNA amin'ny fanandramana transfection sy microinjection.Ity enzyme ity dia mitaky manokana ny RNA miaraka amin'ny cap m7GpppN ho substrate.Tsy afaka mampiasa RNA miaraka amin'ny pN, ppN, pppN na GpppN amin'ny faran'ny 5' izy io.Ny RNA capped dia azo omanina amin'ny alàlan'ny transcription in vitro amin'ny alàlan'ny cap analog na amin'ny alàlan'ny fametahana enzymatic amin'ny alàlan'ny Vaccinia Capping Enzyme.
singa
mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase (50U/μL)
10×Capping Reaction Buffer
fitahirizana
-25 ～- 15 ℃ ho fitehirizana （ Fadio ny tsingerina miverimberina mivaingana）
fitahirizana buffer
20 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100， 50% glycerol.
Famaritana vondrona
Ny singa iray dia faritana ho ny habetsahan'ny anzima ilaina amin'ny methylate 10 pmoles amin'ny transcript RNA 80 nt voapetaka ao anatin'ny adiny 1 amin'ny 37 ° C.
Fanaraha-maso ny kalitao
Exonuclease:50U an'ny mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase miaraka amin'ny 1μg λ-Hind III dia mandevona ADN amin'ny 37 ℃ mandritra ny 16 ora dia tsy miteraka fahasimbana araka ny famaritana ny electrophoresis gel agarose.
Endonuclease: 50 U amin'ny mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase miaraka amin'ny 1 μg λDNA amin'ny 37 ℃ mandritra ny 16 ora dia tsy miteraka fahasimbana araka ny famaritana ny electrophoresis gel agarose.
Nickase: 50U an'ny mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase miaraka amin'ny 1μg pBR322 amin'ny 37 ℃ mandritra ny 16 ora dia tsy miteraka fahasimbana araka ny famaritana ny electrophoresis gel agarose.
RNase: 50U an'ny mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase miaraka amin'ny 1.6μg MS2 RNA mandritra ny 4 ora amin'ny 37 ℃ dia tsy miteraka fahasimbana araka ny famaritana ny electrophoresis gel agarose.
E. coli ADN: 50U an'ny mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase dia voasivana ho an'ny fisian'nyE. coli ADN génomika mampiasa TaqMan qPCR miaraka amin'ny primer manokana ho an'nyE. coli 16S rRNA toerana.nyE. coli Ny fandotoana ADN génomika dia =1E. coli génomé.
Bakteria Endotoxine: LAL-test, araka ny fanontana Sinoa Pharmacopoeia IV 2020, fomba fitsapana fetran'ny gel, fitsipika ankapobeny (1143).Ny votoatin'ny endotoxine bakteria dia tokony ho = 10 EU / mg.
Rafitra fanehoan-kevitra sy fepetra
1. Ampifandraiso amin'ny fatran'ny RNA Capped sy H2O tsy misy RNase ao anaty fantsona microfuge 1,5 mL ka hatramin'ny 16,0 µL ny habeny farany.
2. Afanaina amin'ny 65 ℃ mandritra ny 5 minitra arahin'ny ranomandry mandritra ny 5 minitra.
3. Ampio ireto singa manaraka ireto amin'ny filaharana voatondro (ho an'ny methylation of Capped RNA
latsaky ny 10
| singa fototra | BOKY FAHA- |
| RNA denatured capped | 16 μL |
| 10X Famehezana Reaction Buffer* | 2 μL |
| SAM (4 mM) | 1 μL |
| mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase (50 U/μL) | 1 μL |
| ddH2O | Ny 20 μL |
*10× Fampitandremana Reaction Buffer : 500 mM Tris-HCl(pH 8.0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 , 10 mM DTT.
4. Atsofohy amin'ny 37 ℃ mandritra ny adiny 1 (2 ora incubation no soso-kevitra ho an'ny sombintsombiny kendrena latsaky ny 200 nt).
Applications
Mba hanatsarana ny fanehoana mRNA mandritra ny fanandramana microinjection sy transfection.
Fanamarihana momba ny fampiasana
1. Alohan'ny fanehoan-kevitra, ny ARN dia tokony hodiovina sy levona amin'ny rano tsy misy nokleary, ny vahaolana rehetra dia tsy tokony hisy EDTA sy ion.
2. Aroso ny manafana ny santionany RNA amin'ny 65 ℃ mandritra ny 5 minitra alohan'ny hanesorana ny rafitra faharoa amin'ny 5'end amin'ny transcript.Mety hitarina hatramin'ny 10 min izany ho an'ny firafitry ny terminal complex 5´.
