RTL Reverse Transcriptase
RTL reverse transcriptase dia polymerase ADN miankina amin'ny RNA izay tsy manana hetsika exonuclease 3'→5' ary manana hetsika RNase H.Ity anzima ity dia afaka mampiasa RNA ho lasitra hanambatra tady mifameno amin'ny ADN, izay azo ampiharina amin'ny synthesis cDNA voalohany, indrindra ho an'ny RT-LAMP (fanamafisana isothermal loop-mediated).Raha ampitahaina amin'ny RTL reverse transcriptase 1.0, ny fahatsapana dia mihatsara kokoa, ny fahamarinan-toerana mafana kokoa, ary ny fanehoan-kevitra amin'ny 65 ° C dia miorina kokoa.RTL reverse transcriptase (glycerol free) dia azo ampiasaina hanomanana fanomanana lyophilized, lyophilized RT-LAMP reagents sns.
Famaritana vondrona
Ny singa iray dia mampiditra 1 nmol dTTP ho akora azo arotsaka amin'ny asidra ao anatin'ny 20 minitra amin'ny 50°C amin'ny fampiasana poly(A)•oligo(dT)25 ho modely-primer.
singa
| singa fototra | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Reverse Transcriptase (Tsy misy Glycerol) (15U/μL) | 0,1 mL | 1 mL | 10 mL |
| 10×HC RTL Buffer | 1,5 mL | 4 × 1,5 mL | 5 × 10 mL |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 mL | 2 × 1,5 mL | 3 × 10 mL |
Toetra fitahirizana
Fitaterana eo ambanin'ny 0 ° C ary tehirizina amin'ny -25 ° C ~ -15 ° C.
Fanaraha-maso kalitao
- Asa sisa amin'nyEndonuclease:Ny fanehoan-kevitra 50 μL misy 1 μg an'ny λDNA sy ny 15 RTL2.0 dia nalaina nandritra ny 16 ora tamin'ny 37 ℃ dia mampiseho lamina mitovy amin'ny fanaraha-maso ratsy amin'ny alàlan'ny electrophoresis gel.
- Asa sisa amin'nyExonuclease:Ny fanehoan-kevitra 50 μL misy 1 μg an'ny Hind Ⅲ dia levonina λDNA sy ny 15 RTL2.0 voatsindrona mandritra ny 16 ora amin'ny 37 ℃ dia mampiseho lamina mitovy amin'ny fanaraha-maso ratsy amin'ny alàlan'ny electrophoresis gel.
- Asa sisa amin'nyNickase:Ny fanehoan-kevitra 50 μL misy 1 μg amin'ny pBR322 supercoiled sy 15 RTL2.0 voatsindrona mandritra ny 4 ora amin'ny 37 ° C dia mampiseho lamina mitovy amin'ny fanaraha-maso ratsy amin'ny alàlan'ny electrophoresis gel.
- Asa sisa amin'nyRNase:Ny fanehoan-kevitra 10 μL misy 0.48 μg an'ny MS2 RNA sy 15 unit of RTL2.0 incubated mandritra ny 4 ora amin'ny 37 ° C dia mampiseho lamina mitovy amin'ny fanaraha-maso ratsy amin'ny alàlan'ny electrophoresis gel.
- E. coli gADN:Refesina amin'nyE.coliKit fitiliana HCD manokana，15 RTL2.0 dia misy latsaky ny 1E. coligénomé.
Fametrahana fanehoan-kevitra
cDNA Synthesis Protocol
| singa | BOKY FAHA- |
| Modely RNA a | tsy voatery |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) na Mix Primer Kisendrasendra(60uM) | 2 μL |
| dNTP Mix (10mM tsirairay avy) | 1 μL |
| RNase Inhibitor (40U/uL) | 0,5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10×HC RTL Buffer | 2 μL |
| Rano tsy misy nokleary | Hatramin'ny 20 μL |
Fanamarihana:
1) Ny fatran'ny totalin'ny ARN dia 1ng ~ 1μg
2) Ny fatra natolotry ny mRNA dia 50ng~100ng
Thermo-bisikileta Fepetra ho an'ny mahazatra fanehoan-kevitra:
| Temperature (°C) | Time |
| 25 °Ca | 5 mn |
| 55 °C | 10 mnb |
| 80 °C | 10 mn |
Fanamarihana:
1) Raha ampiasaina ny Mix Primer Random, dia asio incubation amin'ny 25 ° C.
2) Raha ampiasaina ny fifangaroan'ny primer kendrena, dia asiana incubation amin'ny 55°C mandritra ny 10~30mins.
RT-LAMP Protocol
| singa | BOKY FAHA- | Fifantohana farany |
| Template RNA | tsy voatery | ≥10 kopia |
| dNTP Mix (10mM) | 3,5 μl | 1,4 mM |
| FIP/BIP Primer (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| F3/B3 voalohany (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| LoopF/LoopB Primer (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| RNase Inhibitor (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Reaction |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7.5 U/Reaction |
| Bst V2 ADN Polymerase (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Reaction |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 μL | 6 mM (Total 8 mM) |
| 10×HC RTL Buffer (na 10×HC Bst V2 Buffer) | 2,5 μl | 1 × (2mM Mg2+) |
| Rano tsy misy nokleary | Hatramin'ny 25 μL | - |
Fanamarihana:
1) Afangaro amin'ny vortex sy centrifuge vetivety mba hanangona.Incubation mari-pana tsy tapaka amin'ny 65 ° C mandritra ny 1 ora.
2) Ny buffers roa dia mifamatotra ary manana singa mitovy.
-tsoratra
1. Ity vokatra ity dia hamorona solida fotsy rehefa voatahiry amin'ny -20 °C.Esory amin'ny -20 ° C izany ary apetraho amin'ny gilasy mandritra ny 10 minitra eo ho eo.Aorian'ny fandoroana dia azo ampiasaina amin'ny fanozongozonana sy fampifangaroana.
2. Ny vokatra cDNA dia azo tehirizina amin'ny -20 ° C na -80 ° C na ampiasaina avy hatrany amin'ny fanehoan-kevitra PCR.
3. Mba hisorohana ny fandotoana ny RNase dia ataovy madio hatrany ny faritra andrana, ary manaova fonon-tanana sy saron-tava madio mandritra ny fandidiana.
