Vaccinia Virus Capping Enzyme

Vaccinia virus capping enzyme dia avy amin'ny recombinant E. coli strain mitondra ny fototarazo ho an'ny Vaccinia capping enzyme.Ity anzima tokana ity dia ahitana singa roa (D1 sy D12) ary manana hetsika enzymatic telo (RNA triphosphatase sy guanylyltransferase avy amin'ny subunit D1 sy guanine methyltransferase avy amin'ny subunit D12).Vaccinia virus Capping Enzyme dia mahomby amin'ny fampihenana ny fiforonan'ny firafitry ny cap, izay afaka mamehy manokana ny rafitry ny cap 7-methylguanylate (m7Gppp, Cap 0) amin'ny faran'ny 5′ an'ny ARN.Ny rafitra cap (Cap 0) dia mitana anjara toerana lehibe amin'ny fanamafisana ny mRNA, ny fitaterana ary ny fandikana amin'ny eukaryotes.Ny fametahana ny RNA amin'ny alàlan'ny fanehoan-kevitra enzymatic dia fomba mahomby sy tsotra izay afaka manatsara ny fahamarinan-toerana sy ny fandikana ny RNA ho an'ny transcription in vitro, transfection ary microinjection.

singa

Vaksinia Virus Capping Enzyme (10 U/μL)

10×Capping Buffer

Fepetra fitahirizana

-25～- 15 ℃ ho fitehirizana （Fadio ny tsingerina miverimberina mivaingana）

fitahirizana buffer

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glycerol.

Famaritana vondrona

Ny singa iray amin'ny Vaccinia virus Capping Enzyme dia faritana ho ny habetsahan'ny anzima ilaina mba hampidirana ny 10pmol amin'ny GTP ao anaty transcript 80nt ao anatin'ny adiny iray amin'ny 37 ° C.

Fanaraha-maso kalitao

Exonuclease:10U an'ny otrik'aretina Vaccinia Capping Enzyme miaraka amin'ny ADN 1μg λ-Hind III mandevona ADN amin'ny 37 ℃ mandritra ny 16 ora dia tsy miteraka fahasimbana araka ny famaritana ny electrophoresis gel agarose.

Endonuclease:10U an'ny virus Vaccinia Capping Enzyme miaraka amin'ny 1μg λDNA amin'ny 37 ℃ mandritra ny 16 ora dia tsy miteraka fahasimbana araka ny famaritana ny electrophoresis gel agarose.

Nickase:10U an'ny Vaccinia virus Capping Enzyme miaraka amin'ny 1 μg pBR322 amin'ny 37 ℃ mandritra ny 16 ora dia tsy miteraka fahasimbana araka ny famaritana ny electrophoresis gel agarose.

RNase:10U an'ny Vaccinia virus Capping Enzyme miaraka amin'ny 1.6μg MS2 RNA mandritra ny 4 ora amin'ny 37 ℃ dia tsy miteraka fahasimbana araka ny famaritana ny electrophoresis gel agarose.

1.ADN coli:10U an'ny otrik'aretina Vaccinia Capping Enzyme dia voasivana amin'ny fisian'ny ADN génomika E. coli amin'ny fampiasana TaqMan qPCR miaraka amin'ny primer manokana ho an'ny toerana E. coli 16S rRNA.Ny fandotoana ny ADN E. coli dia ≤1 E. coli genome.

2.Bakteria Endotoxine: LAL-test, araka ny fanontana Sinoa Pharmacopoeia IV 2020, fomba fitsapana fetran'ny gel, fitsipika ankapobeny (1143).Ny votoatin'ny endotoxine bakteria dia tokony ho ≤10 EU/mg.

Rafitra fanehoan-kevitra sy fepetra

1. Protocol Capping (habetsan'ny fanehoan-kevitra: 20 μL)

Ity fomba fiasa ity dia azo ampiharina amin'ny fanehoan-kevitry ny 10μg RNA (≥100 nt) ary azo ampitomboina araka ny fitakiana andrana.

I) Atambatra ny RNA 10μg sy ny H2O tsy misy Nuclease ao anaty fantsona microfuge 1,5 ml ka hatramin'ny 15,0 μL ny boky farany.*10×Capping Buffer: 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8.0)

2) Afanaina amin’ny 65°C mandritra ny 5 minitra arahin’ny ranomandry mandritra ny 5 minitra.

3) Ampio ireto singa manaraka ireto amin'ny filaharana voatondro

*10×Capping Buffer:0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH8.0)

4) Atsofohy amin'ny 37 ° C mandritra ny 30 minitra, ny ARN dia voasarona ary vonona ho an'ny fampiharana ambany.

2. 5′ terminal fanehoan-kevitra momba ny marika (volony fanehoan-kevitra: 20 μL)

Ity protocol ity dia natao hametahana ny RNA misy 5' triphosphate ary azo ampitomboina araka ny fangatahana.Ny fahombiazan'ny fampidirana marika dia hisy fiantraikany amin'ny tahan'ny molar an'ny RNA: GTP, ary koa ny votoatin'ny GTP amin'ny santionany RNA.

1) Atambatra ny habetsahan'ny ARN sy ny H2O tsy misy Nuclease ao anaty fantsona microfuge 1,5 ml ka hatramin'ny 14,0 µL ny boky farany.

2) Afanaina amin’ny 65°C mandritra ny 5 minitra arahin’ny ranomandry mandritra ny 5 minitra.

3) Ampio ireto singa manaraka ireto amin'ny filaharana voatondro.

** GTP MIX dia manondro GTP sy marika vitsivitsy.Ho an'ny fifantohana ny GTP, jereoho Note 3.

4) Atsofohy amin'ny 37 ° C mandritra ny 30 minitra, ny faran'ny RNA 5′ dia misy marika ary vonona ny hidina ambany.

Applications

1. Famaranana ny mRNA alohan'ny anaovana fandikan-teny/fandikana in vitro

2. Fametahana 5' faran'ny mRNA

Fanamarihana momba ny fampiasana

1.Ny fanafanana ny vahaolana amin'ny ARN alohan'ny incubation miaraka amin'ny Vaccinia Capping Enzyme dia manala ny rafitra faharoa amin'ny 5'faran'ny transcript.Hanitatra ny fotoana ho 60 minitra ho an'ny fandikan-teny miaraka amin'ny 5'ends fanta-daza.

2. Ny ARN ampiasaina amin'ny fametahana ny fanehoan-kevitra dia tokony hodiovina alohan'ny hampiasana azy ary mihantona amin'ny rano tsy misy nokleary.Tsy tokony hisy EDTA ary tokony tsy misy sira ny vahaolana.

3. Ho an'ny fametahana ny 5' farany, ny totalin'ny GTP dia tokony ho eo amin'ny 1-3 heny amin'ny haavon'ny mRNA amin'ny fanehoan-kevitra.

4. Ny habetsaky ny rafitra fanehoan-kevitra dia azo ampitomboina na midina araka ny tena izy.