M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase dia transcriptase mivadika azo avy amin'ny fitiliana mutation ny fototarazo M-MLV ny Moloney murine leukemia virosy nipoitra sy ny fitenenana ao amin'ny E.coli.Ny enzyme dia manala ny asan'ny RNase H, manana fandeferana amin'ny mari-pana ambony kokoa, ary mety amin'ny fandikana mivadika amin'ny hafanana avo.Noho izany, manampy amin'ny fanafoanana ny fiantraikany ratsy amin'ny rafitra avo lenta RNA sy ny anton-javatra tsy voafaritra amin'ny synthesis cDNA, ary manana fahatoniana ambony kokoa sy ny fahaiza-manao synthesis transcription.Ny anzima dia manana fahamarinan-toerana ambony kokoa sy ny fahaiza-manao synthesis transcription mivadika.
singa
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × Buffer Tady Voalohany (tsy voatery)
* 5 × First-Strand Buffer dia tsy misy dNTP, azafady ampio dNTPs rehefa manomana ny rafitra fanehoan-kevitra
Fampiharana soso-kevitra
1.Dingana iray qRT-PCR.
2.Famantarana otrikaretina RNA.
Toetra fitahirizana
-20°C ho an'ny fitehirizana maharitra, tokony afangaro tsara alohan'ny fampiasana, fadio ny fanala matetika.
Famaritana vondrona
Ny singa iray dia misy 1 nmol dTTP ao anatin'ny 10 minitra amin'ny 37°C amin'ny fampiasana poly(A)•oligo(dT)25toy ny template/primer.
Fanaraha-maso kalitao
1.Ny fahadiovana electrophoretic SDS-PAGE mihoatra ny 98%.
2.Fanamafisana fahatsapana, batch-to-batch fanaraha-maso, fahamarinan-toerana.
3.Tsy misy hetsika nuclease exogenous, tsy misy endonuclease exogenous na fandotoana exonuclease
Fametrahana fanehoan-kevitra ho an'ny Vahaolana Reaction Chain Voalohany
1.Fanomanana ny fangaro fanehoan-kevitra
| singa | BOKY FAHA- |
| Oligo(dT)12-18 Primer na Random Primerny Na Gene Specific Primersb | 50 pml |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Template RNA | Total RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| dH tsy misy RNase2O | Ny 10 μL |
Fanamarihana:a/b: Mifidiana karazana primer isan-karazany araka ny filanao andrana.
2.Afanaina amin'ny 65°C mandritra ny 5mn ary mangatsiatsiaka haingana amin'ny gilasy mandritra ny 2mn.
3.Ampio ireto singa manaraka ireto amin'ny rafitra etsy ambony amin'ny totalin'ny 20µL ary afangaro moramora:
| singa | Volume (μL) |
| 5 × Fiarovana voalohany | 4 |
| Neoscript Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| RNase inhibitor (40 U/μL) | 1 |
| dH tsy misy RNase2O | Ny 20 μL |
4. Azafady, ataovy ny fanehoan-kevitra araka ireto fepetra manaraka ireto:
(1) Raha Random Primer no ampiasaina, ny fanehoan-kevitra dia tokony hatao amin'ny 25 ℃ mandritra ny 10mins, ary avy eo amin'ny 50 ℃ mandritra ny 30 ~ 60mins;
(2) Raha Oligo dT na primers manokana no ampiasaina, ny fanehoan-kevitra dia tokony hatao amin'ny 50 ℃ mandritra ny 30 ~ 60mins.
5.Atsofohy amin'ny 95 ℃ mandritra ny 5 minitra mba tsy hampihetsika ny Neoscript Reverse Transcriptase ary hampitsahatra ny fanehoan-kevitra.
6.Ny vokatra transcription mivadika dia azo ampiasaina mivantana amin'ny fanehoan-kevitry ny PCR sy ny fanehoan-kevitry ny PCR amin'ny fluorescence, na voatahiry amin'ny -20 ℃ mandritra ny fotoana maharitra.
PCR Rhetsika:
1.Fanomanana ny fangaro fanehoan-kevitra
| singa | fifantohana |
| 10 × PCR Buffer (tsy misy dNTP, maimaim-poana Mg²+) | 1× |
| dNTPs (10mM isaky ny dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA Polymerase (5U/μL) | 2-2.5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Endrikany | ≤10% Vahaolana voalohany (2 μL) |
| ddH2O | Ny 50 μL |
Fanamarihana:a: Raha be loatra ny vaha-olana voalohany ampiana dia mety ho voasakana ny fihetsiky ny PCR.
2.PCR Reaction Procedure
| Dingana | hafanana | Time | tsingerina |
| Pre-denaturation | 95 ℃ | 2-5 min | 1 |
| Denaturation | 95 ℃ | 10-20 seg | 30-40 |
| Fanafody | 50-60 ℃ | 10-30 seg | |
| Fanitarana | 72 ℃ | 10-60 seg |
-tsoratra
1.Mety amin'ny famerenana amin'ny laoniny ny mari-pana amin'ny 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.Manana fahamarinan-toerana tsara kokoa izy io, mety amin'ny fanamafisana ny transcription amin'ny hafanana avo.Fanampin'izany, dia tsara amin'ny fandehanana amin'ny fomba mahomby amin'ny faritra ara-drafitra sarotra amin'ny ARN.Ary koa, izanydia mety amin'ny dingana iray multiplex fluorescence quantitative RT-PCR detection.
3.Fifanarahana tsara amin'ny enzymes amplification PCR isan-karazany ary mety amin'ny fanehoan-kevitra RT-PCR mora tohina.
4.Mety amin'ny fanehoan-kevitra RT-PCR avo lenta avo lenta amin'ny fluorescence, manatsara tsara ny tahan'ny fitiliana ny fihenan'ny templates.
5.Mety amin'ny fananganana tranomboky cDNA.
