5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Ampahany : HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) dia fangaro miorina amin'ny fantsona iray miorina amin'ny fantsona iray mety tsara ho an'ny transcription mivadika dingana iray sy PCR quantitative (qRT-PCR).Izy io dia manohana ny fampifangaroana ny primer sy ny probes ary mijanona ho marin-toerana aorian'ny fitehirizana maharitra amin'ny hafanana ambany.Ny santionany hotsapaina dia azo ampiana mivantana rehefa mampiasa, tsy misy fanokafana fantsona fanampiny / fandidiana pipetting.Ity vokatra ity dia manome singa, ohatra, ADN polymerase mafana, M-MLV, uracil DNA glycosylase (TS-UNG), RNase Inhibitor, MgCl.2, dNTPs (miaraka amin'ny dUTP fa tsy dTTP), ary stabiliser.Miaraka amin'ny transcriptase reverse transcriptase sy polymerase ADN, azo atao ny mamita ny fanamafisana PCR ao anatin'ny 20-40 minitra.Ity reagent ity dia mampiasa buffer manokana ho an'ny qPCR miaraka amin'ny enzyme mifangaro amin'ny enzyme amplification anti-inhibitory sy UNG enzyme.Noho izany dia afaka mahazo fanamafisam-peo tsara ny fototarazo kendrena ary misoroka ny fanamafisam-peo diso vokatry ny fandotoana PCR sy aerosol.Ity reagent ity dia mifanaraka amin'ny ankamaroan'ny fitaovana PCR fluorescence quantitative avy amin'ny mpanamboatra toa ny Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad ary Roche.
singa fototra
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Fepetra fitahirizana
Ny singa rehetra dia tokony hotehirizina amin'ny -20 ℃ ho fitahirizana maharitra ary 4 ℃ hatramin'ny 3 volana.Mba afangaro tsara aorian'ny fandoroana sy ny centrifuge alohan'ny hampiasana azy.Fadio ny fanala matetika.
qRT-PCR Reaction System Fiomanana
| singa | 25μLRAFITRA | 50μLRAFITRA | Fifantohana farany |
| 5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5μL | 10μL | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1μL | 2μL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mixa | 1μL | 2μL | 1× |
| Template RNAb | – | – | – |
| ddH2O | Hatramin'ny 25μL | Hatramin'ny 50μL | – |
1) a. Ny fifantohana farany amin'ny primer dia matetika 0.2μM.Ho an'ny vokatra tsara kokoa, ny fifantohana voalohany dia azo atao tsara ao anatin'ny 0.2-1μM.Amin'ny ankapobeny, ny fifantohan'ny probe dia azo atao tsara ao anatin'ny 0.1-0.3μM.
2) b. Rehefa mampiasa fomba PCR haingana, ny fampitomboana ny fifantohan'ny primers sy ny probes dia mety hiteraka vokatra fanamafisam-peo tsara kokoa, ary ny tahan'izy ireo dia tokony hohatsaraina mifanaraka amin'izany.
3) Ny karazana santionany isan-karazany dia misy karazana sy votoatin'ny inhibitor ary isa kopia ny fototarazo kendrena.Ny habetsaky ny santionany dia tokony hojerena amin'ny toe-javatra tena izy.Manaova dilution ny santionany amin'ny rano tsy misy nokleary na TE Buffer, raha ilaina.
Fanehoan-kevitra Conditions
| Fitsipika PCR mahazatra | Fomba PCR haingana | ||||||
| fitsarana | Temp. | Time | tsingerin'ny | fitsarana | Temp. | Time | tsingerin'ny |
| Transcription mivadika | 50 ℃ | 10-20 mn | 1 | Transcription mivadika | 50 ℃ | 5 mn | 1 |
| Polymerase fampahavitrihana | 95 ℃ | 1-5min | 1 | Polymerase fampahavitrihana | 95 ℃ | 30 taona | 1 |
| Denaturation | 95 ℃ | 10-20s | 40-50 | Denaturation | 95 ℃ | 1-3s | 40-50 |
| Fanafody SY Fanitarana | 56-64 ℃ | 20-60s | Fanafody SY Fanitarana | 56-64 ℃ | 3-20s | ||
Fanaraha-maso kalitao
1.Famantarana ny fiasa: fahatsapan-tena, manokana ary famerenana ny qPCR.
2.Tsy misy hetsika nuclease exogenous: tsy misy fandotoana endonuclease exogenous sy exonuclease.
-tsoratra
1.Ny tahan'ny amplification ny ADN polymerase haingana dia tsy latsaky ny 1kb/10s.Ny fitaovana PCR isan-karazany dia manana hafainganana hafainganana sy hafainganana, fomba fanaraha-maso ny mari-pana ary conductivity mafana, ary noho izany dia ilaina ny fanatsarana ny fifantohana voalohany/fanadihadianao sy ny fomba fampandehanana miaraka amin'ny fitaovana PCR haingana anao manokana.
2.Ity vokatra ity dia azo ampiharina be dia be, ary mety amin'ny diagnostika molekiola avo lenta.Fomba telo dingana PCR no soso-kevitra ho an'ny primers amin'ny ambany mari-pana annealing na hanamafisana ny sombiny lava mihoatra ny 200 bp.
3.Satria ny amplicons samy hafa dia manana fahombiazan'ny fampiasana ny dUTP sy ny fahatsapana hafa amin'ny UNG, ny reagents dia tokony hohatsaraina raha mihena ny fahatsapana rehefa mampiasa rafitra UNG.Mifandraisa aminay mba hahazoana fanohanana ara-teknika raha ilaina.
4.Mba hisorohana ny fanamafisan'ny vokatra PCR, dia ilaina ny faritra andrana manokana sy pipette amin'ny fanamafisana.Miasa amin'ny fonon-tanana ary miova matetika ary aza sokafy ny fantsona PCR aorian'ny fanamafisana.
