EndoFree Plasmid Maxi Kit

Fepetra fitahirizana

RNaseA dia tokony ho voatahiry amin'ny -30 ~ -15 ℃ ary entina amin'ny ≤0 ℃.

Endotoxin Scavenger dia azo tehirizina amin'ny 2 ~ 8 ℃ mandritra ny iray volana, voatahiry ao amin'ny -30 ~ -15 ℃ ho fitehirizana maharitraary entina amin'ny ≤0 ℃ .

Ny singa hafa dia tokony hotehirizina amin'ny mari-pana (15 ~ 25 ℃) ary entina amin'ny mari-pana.

singa

RNaseA:10 mg/ml, ampiasaina hanesorana ny ARN.

Buffer P1:buffer fampiatoana bakteria, ampio RNaseA amin'ny Buffer P1 alohan'ny fampiasana voalohany.

Buffer P2:bakteria lysis buffer (misy SDS / NaOH).

Buffer P4:buffer neutralizing.

Endotoxine Scavenger:manala amin'ny fomba mahomby ny endotoxine amin'ny fitrandrahana plasmid crude.

Buffer PW:Sasao ny buffer, ampio ny habetsahan'ny ethanol voalaza alohan'ny fampiasana voalohany.

TB buffer:elution buffer.

Andry FastPure ADN Maxi:Andry adsorption plasmid ADN.

Tube fanangonana 50 ml:fantsona fanangonana filtrate.

Tube fanangonana tsy misy endotoxine:fantsona fanangonana ADN plasmid.

Fitaovana voaomana

Ethanol tanteraka, isopropanol, fantsona centrifuge 50 ml boribory ambany ary 50 ml tsy misy endotoxinefantsona centrifuge.

Applications

Ity vokatra ity dia mety amin'ny fitrandrahana plasmids lehibe amin'ny 150 - 300 ml ny vahaolana bakteria.kolontsaina mandritra ny alina.

Dingana andrana

1. Makà 150 - 200 ml (tsy mihoatra ny 300 ml) ny vahaolana bakteria nokolokoloina nandritra ny alina ary centrifuge amin'nymanodidina ny 11 000 rpm (12 000 × g) mandritra ny 1 – 2 min.Esory ny supernatant ary manangona bakteria.

Δ Rehefa manangona mihoatra ny 50 ml ny bakteria vahaolana, ny bakteria dia azo angonina amin'ny alalan'ny fanampiana bakteria vahaolana, centrifugation, fanariana ny supernatant sy ny dingana hafa ao amin'ny fantsona 50 ml mitovy ho an'ny.

imbetsaka.

2. Ampio 7,5 ml ny Buffer P1 (jereo raha toa ka nampiana RNaseA ny Buffer P1) ao amin'ny centrifuge.fantsona misy bakteria ary afangaro tsara amin'ny vortex na pipetting.

Δ Ny famerenana tanteraka ny bakteria amin'ity dingana ity dia tena zava-dehibe amin'ny vokatra, ary tsy tokony hisy bakteria mitambatra aorian'ny famerenana indray.Raha misy bakteria tsy mifangaro tsara dia hisy fiantraikany amin'ny lysis izany, ka miteraka vokatra sy fahadiovana ambany.Raha 0,65 ny OD600 amin'ny vahaolana bakteria, dia asaina ampiasaina ny 7,5 ml Buffer P1 rehefa maka 150 ml ny vahaolana bakteria;rehefa OD600 dia 0,75 dia tokony hampiasaina 8 ml ny Buffer P1 ary tokony hovana araka izany ny habetsaky ny Buffers P2 sy P4.Raha mitombo ho 200 ml ny habetsahan'ny vahaolana amin'ny bakteria, dia asaina nyNy habetsaky ny buffers P1, P2, ary P4 dia ampitomboina araka ny tokony ho izy.

3. Ampio 7,5 ml buffer P2 amin'ny fampiatoana bakteria manomboka amin'ny dingana 2 ary afangaro moramora miakatra sy midina mandritra ny 6 - 8.fotoana ary incubate amin'ny mari-pana amin'ny efitrano mandritra ny 4 - 5 min.

Δ Avadika moramora mba hifangaro tsara.Ny vortexing dia miteraka ny fizarazaran'ny ADN génomika, ka miteraka sombin-tsolika ADN ao amin'ny plasmid nalaina.Amin'izao fotoana izao, ny vahaolana dia lasa viscous sy translucent, mampiseho fa ny bakteria efa lysed tanteraka.Ny faharetany dia tsy tokony hihoatra ny 5 minitra mba hisorohana ny fandringanana ny plasmids.Raha tsy mazava ny vahaolana dia mety ho be loatra ny bakteria miterakalysis tsy feno, noho izany dia tokony hahena araka ny tokony ho izy ny habetsahan'ny bakteria.

4. Ampio 7,5 ml ny Buffer P4 amin'ny fampiatoana bakteria manomboka amin'ny dingana 3 ary avadika moramora in-6 - in-8 avy hatrany mba hamela ny vahaolana hanaisotra tanteraka ny Buffer P2.Amin'io fotoana io dia tokony hipoitra ny fikorianan'ny flocculent fotsy.Mivezivezy eo amin'ny 11.000 rpm (12.000 × g) mahery mandritra ny 10 - 15 minitra, atsipazo tsara ny supernatant ao anaty fantsona centrifuge 50 ml boribory ambany (voaomana ho azy) vaovao.aspirate ny fotsifotsy mitsinkafona.

Δ Ampio ny buffer P4 ary atsipazo avy hatrany mba hifangaro tsara.Avela hijoro ny fantsona mandra-pizarana ny entona fotsy amin'ny vahaolana mba hisorohana ny famokarana rotsak'orana eo an-toerana izay mety hisy fiantraikany amin'ny neutralization.Raha toa ka tsy misy fanamiana fotsy flocculent precipitate alohan'ny centrifugation ary ny supernatant dia tsy mazava taorian'ny centrifugation, ny fantsona dia mety hocentrifuge mandritra ny 5 min.

5. Ampio 0. 1 heny amin'ny volume (10% amin'ny habetsaky ny supernatant, eo amin'ny 2.2 ml) ny Endotoxin Scavenger amin'ny supernatant manomboka amin'ny dingana 4 ary avereno mifangaro.Apetraho ao anaty ranomandry ny vahaolana na ampidiro ao anaty gilasy voatoto (na vata fampangatsiahana) mandritra ny 5 minitra mandra-piova ny vahaolana avy amin'ny turbid ho mazava sy mangarahara (na mbolasomary mikorontana), ary mifangaro imbetsaka indraindray.

Δ Rehefa ampidirina ao amin'ny supernatant ny Endotoxine Scavenger, dia ho lasa matroka ny supernatant fa nyNy supernatant dia tokony ho mazava (na somary mikorontana) rehefa avy nangatsiaka tao anaty ranomandry.

6. Aorian'ny fametrahana ny supernatant amin'ny mari-pana (> 25 ℃) mandritra ny 10 - 15 min, dia ho lasa mikorontana toy nymitombo ny maripana ao amin'ny efitrano.Avy eo dia tokony havadika ny supernatant mba hifangaro.

Δ Raha ambany kokoa ny mari-pana ao amin'ny efitrano na tianao hampihenana ny fotoana fitrandrahana, dia azo atao anaty rano fandroana 37 ~ 42 ℃ ny supernatant mandritra ny 5 - 10 min ary ny dingana manaraka dia azo atao aorian'ny supernatant.lasa mikorontana.

7. Afangaro ny supernatant amin'ny 11,000 rpm (12,000 × g) eo ho eo mandritra ny 10 minitra amin'ny mari-pana amin'ny efitrano (tsy maintsy> 25 ℃ ny hafanana) mba hampisaraka ny dingana.Ny dingan'ny rano ambony dia misy ny ADN raha ny sosona manga misy menaka ambany kosa dia misy endotoxine sy loto hafa.Famindrana nyADN-misy dingana rano amin'ny fantsona vaovao aryario ny sosona misy menaka.

Δ Ny mari-pana mandritra ny centrifugation dia tsy maintsy mihoatra ny 25 ℃ satria tsy misy fisarahana mahombymitranga raha ambany loatra ny mari-pana.

Δ Raha tsy mahomby ny fisarahana amin'ny dingana, ny mari-pana centrifugation dia azo ahitsy amin'ny 30 ℃ aryny fotoana centrifugation dia azo ampitomboina ho 15 min.

Δ Aza mitsentsitra ny sosona menaka manga fa misy endotoxine sy loto hafa.

rafitra

Resuspension Lysis Neutralization

◇ Ampio 7,5 ml Buffer P1

◇ Ampio 7,5 ml Buffer P2

◇ Ampio 7,5 ml Buffer P4

Fanalana endotoxine

◇Ampiana 0. in-1 ny habetsaky ny endotoxine Scavenger

Famatorana sy fanasana

◇ Ampio in-0,5 heny ny habetsahan’ny isopropanol

◇ Ampio 10 ml Buffer PW