M-MLV Reverse Transcriptase
RevScript Reverse transcriptase dia azo avy amin'ny teknolojian'ny génétique.Izy io dia manana fahaiza-manao synthesis cDNA avo kokoa, fitoniana mafana ary fetran'ny mari-pana (hatramin'ny 60 ° C).Ny vokatra cDNA synthesized dia hatramin'ny 10 kb.Manatsara ny fifandraisan'ny môdely izy io ary mety amin'ny fandikana mivadika ny môdely RNA misy rafitra faharoa sarotra na fototarazo dika mitovy.
singa
| singa fototra | HC2003B (10.000U) | HC2003B (5*10.000U) | HC2003B (200.000U) |
| RevScript Reverse Transcriptase (200U/μL) | 50 μL | 5 × 50 μL | 1 mL |
| 5 × RevScript Buffer | 250 μL | 1,25 mL | 5 mL |
Toetra fitahirizana
Ity vokatra ity dia tokony hotehirizina amin'ny -25 ° C ~ -15 ° C mandritra ny 2 taona.
Famaritana vondrona
Ny singa iray dia mampiditra 1 nmol dTTP ho fitaovana tsy mety levona asidra ao anatin'ny 10 minitra amin'ny 37 ° C amin'ny fampiasana Oligo (dT) ho primer.
Fametrahana fanehoan-kevitra
1.Denaturation of RNA template (Ity dingana ity dia tsy voatery, denaturation ny RNA template dia manampy amin'ny fanokafana ireo rafitra faharoa, izay hanatsara ny vokatra amin'ny cDNA voalohany.)
| singa | Volume (μL) |
| RNase free ddH2O | To 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) na Primer Kisendrasendra (50 μmol/L) Na ny fototarazo manokana (2 μmol/L) | 1 |
| na 1 | |
| na 1 | |
| Modely RNA | X a |
Fanamarihana:
1) a: ARN manontolo: 1-5 ug na mRNA: 1-500 ng
2) Ampidirina amin'ny 65°C mandritra ny 5 minitra, avy eo afindra amin'ny gilasy avy hatrany mba hampangatsiaka mandritra ny 2 minitra.Fohy centrifugation mba hanangona fanehoan-kevitra ranon-javatra, ampio ny reverse transcription fanehoan-kevitra vahaolana araka ny aseho eo amin'ny tabilao manaraka.Afangaro amin'ny pipette moramora.
1.Fanomanana ny fangaro fanehoan-kevitra (volony 20 μL)
| singa | Volume (μL) |
| Fifangaroan'ny dingana teo aloha | 13 |
| 5×Buffer | 4 |
| dNTP Mix (10nmol/L) | 1 |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| RNase inhibitor (40 U/μL) | 1 |
1.Ataovy ny fanehoan-kevitra amin'ireto fepetra manaraka ireto:
| Temperature (°C) | Time |
| 25 °Ca | 5 mn |
| 42 °Cb | 15-30 mn |
| 85 °Cc | 5 mn |
Fanamarihana:
1) a.Ny fampidiran-dresaka amin'ny 25 ° C mandritra ny 5 minitra dia ilaina raha tsy mampiasa ny hexamers kisendrasendra.Tsidiho azafady ity dingana ity rehefa mampiasa Oligo (dT)18na Gene Specific Primer.
2) b.Ny mari-pana amin'ny fandikana mivadika dia 42 ° C, Ho an'ny môdely manana rafitra faharoa sarotra na votoaty GC avo lenta, dia soso-kevitra ny hampiakatra ny hafanana ho 50-55 ° C.
3) c.Afanaina amin'ny 85°C mandritra ny 5mins mba tsy hampihetsika ny reverse transcriptase.
4) Ny vokatra dia azo ampiasaina mivantana amin'ny PCR na qPCR fanehoan-kevitra, na voatahiry amin'ny -20 ° C ho an'ny fitehirizana fohy.Amporisihina ny manasaraka ny vokatra ary mitahiry amin'ny -80 ° C ho an'ny fitehirizana maharitra.Fadio ny fanala matetika.
5) Ny vokatra dia mety amin'ny dingana iray RT-qPCR, dia soso-kevitra ny hanampy 10-20 U reverse transcriptase isaky ny 25μL rafitra fanehoan-kevitra, na hampitombo tsikelikely ny mivadika transcriptase araka ny tena toe-javatra.
-tsoratra
1.Azafady, ataovy madio ny faritra andrana;Tokony hanaovana fonon-tanana madio sy saron-tava mandritra ny fandidiana.Ny fitaovana ampiasaina amin'ny fanandramana dia tokony ho RNase maimaim-poana mba hisorohana ny fandotoana RNase.
2.Ny fomba rehetra dia tokony hatao amin'ny ranomandry mba hisorohana ny fahasimban'ny ARN.
3.Ny santionany RNA avo lenta dia atolotra mba hiantohana ny fahombiazan'ny fandikana mivadika.
4.Ity vokatra ity dia natao ho an'ny fikarohana ihany.
5.Azafady, miasa miaraka amin'ny palitao laboratoara sy fonon-tanana fanariana, ho fiarovana anao.
