Temperature sensitive UNG
Temperature Sensitive UNG (TS-UNG) dia azo avy amin'ny fanehoana recombinant ao amin'ny E. coli.Ny anzima dia mampiakatra ny famoahana uracil maimaim-poana avy amin'ny ADN tokana misy tady roa sy uracil ary tsy mavitrika amin'ny ARN.Raha oharina amin'ny mahazatra UNG anzima ny E. coli fototarazo fiaviana, TS-UNG anzima manana asa ambony kokoa amin'ny ambany mari-pana (20 ℃ ~ 37 ℃) ary ny mari-pana saro-pady sy mora inactivated (50 ℃), manalavitra ny fahasimban'ny dUTP-misy amplification. vokatra amin'ny mari-pana amin'ny alàlan'ny hetsika sisa tavela izay mety hijanona aorian'ny tsy fihetsehan'ny enzyme UNG mahazatra.Noho izany, ny anzima TS-UNG dia tsy mety amin'ny fanehoan-kevitra fisorohana ny fandotoana PCR, fa mifanaraka tsara amin'ny programa fanamafisam-peo RT-PCR ary azo ampiasaina amin'ny fanehoan-kevitra fisorohana ny fandotoana RT-PCR.
Fampiharana soso-kevitra
Fanamafisana ny fisorohana ny loto
Toetra fitahirizana
-20°C ho an'ny fitehirizana maharitra, tokony afangaro tsara alohan'ny fampiasana, fadio ny fanala matetika.
fitahirizana buffer
20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, Stabilizer, 50% Glycerol.
Famaritana vondrona
Ny habetsahan'ny anzima ilaina amin'ny fanimbana ny 1µg amin'ny ADN tady tokana misy fototra dU ao anatin'ny adiny 1 amin'ny 37°C dia singa 1 asa (U).
Fanaraha-maso kalitao
1.SDS-PAGE electrophoretic fahadiovana mihoatra ny 98%
2.Hetsika fanimbana, fifehezana batch-to-batch, fitoniana
3.Tsy misy hetsika nuclease exogenous, tsy misy endonuclease exogenous na fandotoana exonuclease.
torolalana
| singa | Vola (μL) | fifantohana farany |
| 10 × PCR Buffer (tsy misy dNTP, Mg²+maimaim-poana) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (soloina dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1.25 U |
| 1 U/μLTS-UNG | 0.5 (0.1-0.5) | 0,5 U (0,1-0,5U) |
| 25 × Fangaro voalohanyny | 2 | 1× |
| Endrika | - | <1μg/fihetsika |
| ddH₂O | To 50 | - |
Fanamarihana: a: Raha ampiasaina amin'ny qPCR/qRT-PCR, dia tokony hampidirina ao amin'ny rafitra fanehoan-kevitra ny probe fluorescent.Matetika, ny fifantohana primer farany amin'ny 0,2 μM dia afaka manome vokatra tsara;rehefa mahantra ny fanehoan-kevitra, dia azo ahitsy ny fifantohana voalohany amin'ny 0.2-1 μM.Amin'ny ankapobeny, ny fifantohan'ny probe dia tsara indrindra amin'ny 0.1-0.3 μM.Ny andrana gradient concentration dia azo atao mba hahitana ny fitambaran'ny primer sy probe tsara indrindra.
-tsoratra
1.Ny mari-pana tsara indrindra amin'ny TS-UNG anzima dia somary ambany, ary azo optimized amin'ny isan-karazany ny 20 ℃ ~ 37 ℃, ny fatra ny anzima sy ny fanehoan-kevitra ny fotoana dia azo optimized amin'ny isan-karazany ny 0.1 ~ 0.5 U, 5 ~ 10 min;ary ny anzima dia mety ho tsy mavitrika amin'ny dingan'ny fandikana mivadika.
2.Mety amin'ny PCR sy RT-PCR izy io mba hisorohana ny fandotoana.
3.Ialao ny fanalefahana matetika, ary aza avela hiovaova be ny mari-pana.
4.Ny fototarazo samihafa ampitomboina dia manana fahombiazan'ny fampiasana ny dUTP sy ny fahatsapana ho an'ny enzyme UNG, noho izany, raha ny fampiasana ny rafitra UNG dia mitarika ho amin'ny fihenan'ny fahatsapan'ny fahitana, ny rafitra fanehoan-kevitra dia tokony ahitsy sy amboarina, raha mila fanohanana ara-teknika ianao, azafady mifandraisa ny orinasanay.
