Proteinase K mNGS (ranoka)
Proteinase K dia protease serine marin-toerana miaraka amin'ny karazana substrate malalaka.Manimba proteinina maro ao amin'ny firenena teratany na dia eo aza ny fanasan-damba.Ny porofo avy amin'ny fandalinana ny rafitra kristaly sy molekiola dia manondro fa ny anzima dia an'ny fianakaviana subtilisin miaraka amin'ny triad catalytic toerana mavitrika (Asp).39Josefa sy Maria69- Ser224).Ny toerana lehibe indrindra amin'ny cleavage dia ny fatorana peptide mifanakaiky amin'ny vondrona carboxyl amin'ny alifatika sy asidra amine aromatika miaraka amin'ny vondrona amino alpha voasakana.Matetika izy io no ampiasaina amin'ny endriny manokana.Ity proteinase K ity dia natao manokana ho an'ny mNGS.Raha ampitahaina amin'ny proteinase K hafa, dia misy fandotoana asidra nokleika kely kokoa miaraka amin'ny fampisehoana enzymatic mitovy, izay afaka miantoka tsara kokoa ny fampiharana mNGS midina.
Fepetra fitahirizana
2-8 ℃ mandritra ny 2 taona
famaritana
| Bika Aman 'endrika | Tsy misy loko ka hatramin'ny ranon-javatra volontany mazava |
| asa | ≥800 U/ml |
| Ny fifantohana proteinina | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Tsy nisy hita |
| DNase | Tsy nisy hita |
| RNase | Tsy nisy hita |
Properties
| laharana EC | 3.4.21.64(Recombinant avy amin'ny rakikira Tritirachium) |
| Isoelectric teboka | 7.81 |
| pH tsara indrindra | 7.0-12.0 Fig. 1 |
| Temperature tsara indrindra | 65 ℃ Fig. 2 |
| fahamarinan-toerana pH | pH 4.5-12.5 (25 ℃, 16 h) Sary 3 |
| Ny fahamarinan-toerana mafana | Ambany 50 ℃ (pH 8.0, 30 min) Fig. 4 |
| Fitahirizana fahamarinan-toerana | Mihoatra ny 90% hetsika mandritra ny 12 volana amin'ny 25 ℃ |
| Activators | SDS, urea |
| Inhibitors | diisopropyl fluorophosphate;phenylmethylsulfonyl fluoride |
Applications
1. Kitapo diagnostika génétique
2. Fitaovana fitrandrahana ARN sy ADN
3. Ny fitrandrahana ny singa tsy proteinina avy amin'ny tavy, ny fanimbana ny loto proteinina, toy ny ADNvaksiny sy fanomanana ny heparin
4. Fanomanana ny ADN chromosome amin'ny alalan'ny electrophoresis pulsed
5. Western blot
6. Enzymatic glycosylated albumin reagents in vitro diagnostics
Fisorohana
Manaova fonon-tanana sy solomaso fiarovana rehefa mampiasa na milanja, ary tehirizo tsara ny rivotra aorian'ny fampiasana.Ity vokatra ity dia mety hiteraka allergie na tsy fahazakana amin'ny hoditra sy fahasosorana lehibe amin'ny maso.Raha sitrana dia mety hiteraka allergie na tsy fahazakana soritr'aretina na dyspnea.Mety hiteraka fahasosorana taovam-pisefoana.
Famaritana vondrona
Ny singa iray (U) dia faritana ho ny habetsahan'ny anzima ilaina amin'ny hydrolyze kaseine mba hamokarana 1 μmoltyrosine isa-minitra amin'ny fepetra manaraka.
Fiomanana reagents
Reagent I: 1g ronono casein dia levona amin'ny 50ml ny 0.1M sodium phosphate solution (pH 8.0), incubated amin'ny rano 65-70 ℃ mandritra ny 15mins, nesorina sy levona, nangatsiaka tamin'ny rano, namboarina tamin'ny hydroxide sodium ho pH 8.0, ary raikitra ny volume. 100ml.
Reagent II: 0.1M trichloroacetic asidra, 0.2M ny sodium acetate, 0.3M acetic asidra.
Reagent III: 0.4M Na2CO3vahaolana.
Reagent IV: Reagent forint nototoina in-5 tamin'ny rano madio.
Reagent V: Enzyme diluent: 0.1M ny sodium phosphate solution (pH 8.0).
Reagent VI: vahaolana tyrosine: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol / ml tyrosine levona amin'ny 0,2M HCl.
fitsarana
1. 0.5ml ny reagent I dia efa mafana mialoha ny 37 ℃, ampio 0.5ml ny anzima vahaolana, afangaro tsara, ary incubate amin'ny37 ℃ mandritra ny 10 minitra.
2. Asio réagent II 1ml mba hampijanonana ny réagent, afangaro tsara ary tohizo ny incubation mandritra ny 30mn.
3. Vahaolana fanehoan-kevitra centrifugate.
4. Maka 0,5ml supernatant, asio 2,5ml réagent III, 0,5ml réagent IV, afangaro tsara ary atsangano amin'ny 37 ℃mandritra ny 30 mn.
5. OD660nofaritana ho OD1;vondrona fanaraha-maso banga: 0.5ml reagent V no ampiasaina hanoloana anzimavahaolana hamaritana ny OD660toy ny OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. L-tyrosine mahazatra curve: 0.5mL samy hafa fifantohana L-tyrosine vahaolana, 2.5mL Reagent III, 0.5mL Reagent IV amin'ny 5mL centrifuge fantsona, incubate amin'ny 37 ℃ mandritra ny 30mins, mamantatra ny OD660ho an'ny fifantohana samihafa amin'ny L-tyrosine, dia nahazo ny curve mahazatra Y=kX+b, izay Y ny fifantohana L-tyrosine, X dia OD600.
Kajy
2: Tontalin'ny habetsahan'ny vahaolana (mL)
0.5: Ny habetsahan'ny vahaolana anzima (mL)
0.5: Ny habetsahan'ny ranon-javatra ampiasaina amin'ny famaritana chromogenic (mL)
10: Fotoana fanehoan-kevitra (min)
Df: Fandotoana maro
C: Fifantohan'ny enzyme (mg/mL)
References
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,EUR.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Cloning Molecular: Boky Torolàlana momba ny laboratoara, andiany faha-2, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
tarehimarika
aviavy.1 Optimum pH
Vahaolana buffer 100mM: pH6.0-8.0, Na-phosphate;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9,0-12,5, Glycine-NaOH
Fig.2 Temperature tsara indrindra
Fihetseham-po amin'ny 20 mM K-phosphate buffer pH 8.0.Fifantohan'ny enzyme: 1 mg/mL
Fig.3 pH fahamarinan-toerana
25 ℃, 16 h-fitsaboana miaraka amin'ny vahaolana buffer 50 mM: pH 4.5- 5.5, Acetate;pH 6.0-8.0, Na-phosphate;pH 8.0-9.0, Tris-HCl.pH 9.0-12.5, Glycine-NaOH.Fifantohan'ny enzyme: 1 mg/mL
Fig.4 Thermal fahamarinan-toerana
Fitsaboana 30 minitra miaraka amin'ny buffer Tris-HCl 50 mM, pH 8.0.Fifantohan'ny enzyme: 1 mg/mL
Fig.5 Fitehirizana stability at 25 ℃
