Superstart qPCR Premix plus-UNG
Ampahany : HCB5071E
Superstart qPCR Premix plus-UNG dia reagent manokana natao ho an'ny PCR Real Time PCR qualitative sy quantitative fanehoan-kevitra amin'ny alalan'ny fikarohana mifototra amin'ny fikarohana, novolavolaina manokana ho an'ny lyophilization dingana.Izy io dia misy anzima vaovao Hotstart Taq plus (DG), izay manana ny asan'ny enzyme Taq voaisy tombo-kase amin'ny mari-pana amin'ny efitrano, manakana amin'ny fomba mahomby ny fanamafisana tsy voafaritra nateraky ny fananganana tsy voafaritra manokana na ny fananganana dimer primer ao anatin'ny toetry ny mari-pana ambany, ka manatsara. ny specificity ny amplification fanehoan-kevitra.Ity reagent ity dia mampiasa buffer manokana qPCR optimized sy rafitra manohitra ny fandotoana UNG / dUTP mba hahatratrarana ny fanombohana mafana haingana, manatsara ny fahombiazany sy ny fahatsapan'ny fanehoan-kevitra qPCR.Afaka mahazo miolakolaka manara-penitra tsara ao amin'ny faritra isan-karazany quantitation ary manatanteraka araka ny marina quantitation, amin'ny fomba mahomby ny fisorohana ny diso fanamafisam-peo tsara vokatry ny residual PCR vokatra na aerosol loto.Ity reagent ity dia mifanaraka amin'ny ankamaroan'ny fitaovana PCR fluorescent quantitative avy amin'ny mpanamboatra toy ny Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad ary Roche sns., ary mampiseho fitoniana tsara amin'ny endrika lyophilized.
Reagent composition
1. 5×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+maimaim-poana) (DG)
2. 250 mM MgCl2
3. 4×lyoprotectant (tsy voatery)
Fepetra fitahirizana
Fitehirizana maharitra amin'ny -20 ℃;azo tehirizina amin'ny 4 ℃ hatramin'ny 3 volana.Afangaro tsara alohan'ny fampiasana aryfadio ny fanala miverimberina sy ny fanalefahana.
Protocol amin'ny bisikileta
| fitsarana | Temp. | Time | tsingerin'ny |
| Fandevonan-kanina | 50 ℃ | 2 min | 1 |
| Fampahavitrihana polymerase | 95 ℃ | 1~5 min | 1 |
| Denature | 95 ℃ | 10~20 s | 40-50 |
| Fanilihana sy fanitarana | 56~64 ℃ | 20-60 s | 40-50 |
qPCR Liquid Reaction SyFiomanana taho
|
fifehezan |
Volume 25µL |
50µL Volume |
Fifantohana farany |
| 5×HotstartPremix plus-UNG(Mg2+maimaim-poana) (DG) | 5µL | 10µL | 1× |
| 250 mM MgCl2 | 0,45µL | 0,9µL | 4,5 mM |
| 4×lyoprotectant1 | 6.25µL | 12.5µL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mix2 | 1µL | 2µL | 1× |
| ADN template3 | —— | —— | —— |
| ddH2O | Ny 25µL | Ny 50µL | —— |
1. Ny fifantohana farany amin'ny 0.2μM ho an'ny primers matetika dia manome vokatra tsara;rehefa ratsy ny fanehoan-kevitra, amboary ny fifantohana voalohany ao anatin'ny 0.2-1μM raha ilaina.Ny fifantohana amin'ny probe dia mazàna optimized ao anatin'ny 0.1-0.3μM amin'ny alàlan'ny andrana gradient hahitana fitambarana tsara indrindra.
2. Miovaova ny isan'ny dika mitovy amin'ny fototarazo kendrena ao anatin'ny karazana môdely;raha ilaina, dia azo atao ny dilution gradient mba hamaritana ny habetsahan'ny fanampim-panampiana tsara indrindra.
3. Ity rafitra ity dia azo lyophilized;Rehefa mampiasa ity rafitra ity ny mpanjifa tsy misy fepetra fanamainana mangatsiaka, dia azo ampiana 4 × lyoprotectant; raha misy vokatra maina mangatsiaka ilaina, mandritra ny fanamafisana ny vokatra vita amin'ny reagents, dia tsy maintsy ampiana 4 × lyoprotectant mba hiantohana ny tsy fitoviana amin'ny singa rafitra lyophilized ary vokany.
Rehefa ampiasaina ny rafitrad ho an'ny fanamainana mangatsiaka, omano ny RAFITRA as manaraka ireto:
| fifehezan | 25µL Reaction System |
| 5 ×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+maimaim-poana) (DG) | 5µL |
| 250 mM MgCl2 | 0,45µL |
| 4×lyoprotectant | 6.25µL |
| 25×Primer-Probe Mix | 1µL |
| ddH2O | Ny 18~20µL |
* Raha mila rafitra hafa amin'ny fanamainana mangatsiaka, azafady mba jereo misaraka.
Lyophilization dinganass
| fitsarana | Temp. | Time | toe-javatra | tsindry |
| Mialoha ny hatsiaka | 4 ℃ | 30 min | MANOHANA |
1 atm |
| -50 ℃ | 60 min | hihena | ||
| -50 ℃ | 180 min | MANOHANA | ||
| Fanamainana voalohany | -30 ℃ | 60 min | fanafanana |
Vacuum farany |
| -30 ℃ | 70 min | MANOHANA | ||
| Fanamainana faharoa | 25 ℃ | 60 min | fanafanana |
Vacuum farany |
| 25 ℃ | 300 min | MANOHANA |
2. Ny dingana lyophilization etsy ambony dia natao ho an'ny fanondroana fotsiny.Ny karazana vokatra samihafa sy ny fanamainana fanamainana samihafa dia manana masontsivana samihafa, ka azo atao ny fanitsiana araka ny tena izy.fepetra mandritra ny fampiasana.
3. Ny fizotry ny lyophilization samihafa dia mety ho an'ny haben'ny lyophilized samihafavokatra, noho izany dia tsy maintsy atao ny fanamarinana fitiliana ampy rehefa ampiasaina amin'ny famokarana lehibe.
Torolàlana amin'ny fampiasana lyophilized vovoka
1. Fohy centrifuge ny lyophilized vovoka;
2. Ampio ny lasitra asidra nokleika amin'ny vovoka lyophilized ary ampio rano hatramin'ny 25μL;
3. Afangaro tsara amin'ny centrifugation ary mandehana amin'ny milina.
Fanaraha-maso kalitao:
1. Fitsapana miasa: fahatsapan-tena, manokana, reproducibility ny qPCR.
2. Tsy misy hetsika nuclease exogenous, tsy misy fandotoana endo/exonuclease exogenous.
Fampahalalana ara-teknika:
1. Superstart qPCR Premix plus-UNG dia mampiasa anzima fanombohana mafana vaovao izay ahafahana manomboka mafana haingana ao anatin'ny 1 ~ 5 minitra;amin'ny alàlan'ny famolavolana buffer manokana dia mety amin'ny fanehoan-kevitra PCR marobe fluorescent.
2. Manana specificity ambony kokoa izay manatsara be ny fahatsapana ny fluorescence quantitative PCR fetra detection, manao amplification curves normalization, fluorescence sanda mahazo fanatsarana miharihary amin'ny ambany fifantohana templates, mety ho avo saro-pady fluorescence quantitative PCR detection reagents.
3. Ho an'ny primer manana mari-pana ambany kokoa na mihoatra ny sombiny 200bp, dia soso-kevitra ny fomba 3-dingana.
4. Ny fahombiazan'ny fampiasana ny dUTP sy ny fahatsapan'ny enzyme UNG dia tsy mitovy amin'ny fototarazo kendrena samihafa, ka raha ny fampiasana ny rafitra UNG dia mitarika amin'ny fihenan'ny fahatsapan'ny maso, ny rafitra fanehoan-kevitra dia tokony hanitsy sy hohatsaraina.Raha ilaina ny fanohanana ara-teknika dia mifandraisa amin'ny orinasanay.
5. Mampiasà faritra voatokana sy pipettes mialoha sy aorian'ny fanamafisam-peo, manaova fonon-tanana mandritra ny fandidiana ary soloy matetika;aza sokafy ny fantsona fanehoan-kevitra rehefa vita ny PCR mba hampihenana ny fandotoana ny santionany amin'ny vokatra PCR.
