Fitaovana PCR mivantana
Saka No: HCR2020A
Plant Direct PCR Kit dia mety amin'ny fanamafisana mivantana ny ravin'ny zavamaniry, ny voa, sns., ary azo ampiasaina amin'ny fitiliana avo lenta amin'ny santionan'ny zavamaniry izay tsy misy polysaccharides sy polyphenols.Ny polymerase ADN fanamafisana mivantana mifototra amin'ny evolisiona mivantana dia manana fandeferana ambony kokoa amin'ny mpikatroka PCR amin'ny zavamaniry.Mandritra izany fotoana izany, mitazona ny fampisehoana avo lenta izy io, izay mety amin'ny fampitomboana ny sombintsombin'ny ADN ao anatin'ny 5 kb.Ny Lysis buffer A tsy manam-paharoa ao amin'ny kitapo dia azo ampiasaina hanesorana ny tavy zavamaniry vaovao na mangatsiaka.Mora ny miasa ary ny lysate dia azo ampiasaina ho modely amin'ny fanamafisana tsy misy fanadiovana.Ny rafitra dia misy fitaovana fiarovana izay ahafahan'ny santionany tsy mitsaha-mitombo amin'ny fomba mahomby aorian'ny fanamainana miverimberina sy ny fandoroana.2 × Plant Direct Master Mix ihany no mila manampy primers sy môdely hanaovana fanehoan-kevitra fanamafisana, amin'izay dia mampihena ny fiasan'ny pipetting sy manatsara ny fizotran'ny fitiliana sy ny famerenana ny vokatra.
singa
| singa | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Plant Direct Master Mix | 1,25 ml | 4 × 1,25 ml |
| Plant Direct Lysis Buffer A | 5 ml | 20 ml |
| Plant Direct Lysis Buffer B* | 5 ml | 20 ml |
* Ny Plant Direct Lysis Buffer B dia reagent azo atao, izay ampiasaina mba hanalavirana ny Plant Direct Lysis Buffer A mba hanalava ny fotoana fitehirizana ny santionany.Azo ampiasaina araka ny zava-misy marina izy io.
Fepetra fitahirizana
2 × Plant Direct Master Mix, tehirizo ao amin'ny -30 ~ -15 ℃ ary aza miverimberina ny hatsiaka sy ny fanalefahana;Plant Direct Lysis Buffer, mitahiry amin'ny -30 ~ -15 ℃ na 2 ~ 8 ℃.
Dingana andrana
Fanodinana santionany–Ravinkazo
fomba mivantana:Tsara ny mampiasa ravinkazo tanora.Mampiasà totohondry lavaka misy savaivony 0.5 - 3 mm mba hahazoana santionany kely sy fanamiana, ary ampio mivantana ny santionany amin'ny rafitra PCR (rafitra 50 μl no soso-kevitra).Mariho fa ny santionany dia ao anaty vahaolana PCR fa tsy amin'ny rindrina fantsona.Raha PCR mivantana no ampiasaina hanamafisana ny sombiny lava sy santionany sarotra, ny fampiasana santionany misy savaivony kely kokoa (0.5 – 1 mm) ho lasitra dia afaka manampy amin'ny fahazoana vokatra tsara kokoa.
Fomba fikosoham-bary:Tsara ny mampiasa ravinkazo tanora.Maka ravinkazo kely (1 – 3 mm eo ho eo ny savaivony), apetraho ao anaty 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab izy, ary kosohy araka izay azo atao (azo atao amin’ny alalan’ny fanosorana ny ravina amin’ny tendron’ny pipette 100 μl io dingana io. mash ny santionany).Raha ampiasaina ny tavy ravina lehibe kokoa (tsy mihoatra ny 7 mm), ampitomboy ny habetsaky ny buffer dilution ho 50 μl.Rehefa voatoto ny ravina dia tokony hiseho maitso ny vahaolana.Taorian'ny centrifugation fohy, ampio 1 μl ny supernatant ny rafitra PCR ho toy ny fanehoan-kevitra templatec.
Thermal lysis fomba:Tsara ny mampiasa ravinkazo tanora.Maka ravinkazo kely (1 – 3 mm eo ho eo ny savaivony), apetraho ao anaty 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A, ary hafanaina amin’ny 95°C mandritra ny 5 – 10 min.Ny fotoana lysis dia azo ampitomboina araka ny tokony ho izy ho an'ny ravina sarotra lyse (tsy mihoatra ny 20 min).Raha ampiasaina ny tavy ravina lehibe kokoa (tsy mihoatra ny 7 mm), ampitomboy ny habetsaky ny buffer dilution ho 50 μl.Aorian'ny famafazana dia mitsambikina vetivety, ary ampio 1 μl ny supernatant amin'ny rafitra PCR ho modely fanehoan-kevitrab.
Fanodinana santionany– Voankazo
Fomba fikosoham-bary:Mampiasà scalpel hanapahana masomboly misy savaivony 5 mm, ampio amin'ny 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A, ary totoho ny santionany amin'ny tendron'ny pipette na fitaovana hafa.Vortex vetivety ary avelao hijanona amin'ny mari-pana mandritra ny 3-5 minitra.Ataovy azo antoka fa ny santionan'ny voa dia rendrika ao amin'ny buffer dilution.Aorian'ny centrifugation fohy, ampio 1 μl ny supernatant amin'ny rafitra PCR ho modely fanehoan-kevitra.
Thermal lysis fomba:Mampiasà scalpel hanapahana voa misy savaivony 5 mm, ampio amin'ny 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A, ary hafanaina amin'ny 95 ° C mandritra ny 5 - 10 min.Ny fe-potoana lysis dia azo itarina araka ny tokony ho izy ho an'ny ravina sarotra lyse (tsy mihoatra ny 30 min).Aorian'ny famafazana dia atao centrifuge vetivety, ary ampio supernatant 1 μl amin'ny rafitra PCR ho toy ny template fanehoan-kevitrab.
a.Ny hety na fitaovana hafa dia azo ampiasaina hanapahana santionany amin'ny habeny mety;raha ampiasaina indray ny totohondry na hety, dia tokony hodiovina amin'ny 2% ny sodium hypochlorite solution alohan'ny fampiasana tsirairay mba hisorohana ny fifandonana eo amin'ny santionany.
b.Ataovy azo antoka fa levona tanteraka ny Plant Direct Lysis Buffer alohan'ny hampiasana azy.Raha viscous na misy ranon-javatra ny buffer, dia azo hafanaina amin'ny 37 ℃ mba hiempo azy tanteraka alohan'ny fampiasana.
c.Ny habetsahan'ny môdely ao amin'ny rafitra fanehoan-kevitra dia azo amboarina araka ny tokony ho izy araka ny fahasamihafan'ny habetsaky ny akora sy ny diluent ampiana.
Plant Direct Lysis Buffer
Ny Plant Direct Lysis Buffer A voarakitra ao anatin'ity vokatra ity dia natao tsara indrindra mba hamoahana ny fototarazon'ny ankamaroan'ny tadin'ny zavamaniry ary mety amin'ny fitehirizana fohy ny zavamaniry manta amin'ny 4 ℃.Raha toa ka mila tehirizina mandritra ny fotoana lava kokoa ny santionany (ohatra, 1 – 2 volana), dia asaina mamindra ny supernatant amin'ny fantsona EP vaovao ary mitahiry izany amin'ny -20 ℃.Mba hitehirizana ny santionany ho azo antoka kokoa, ampio ny habetsahan'ny Plant Direct Lysis Buffer B mitovy amin'ny supernatant nafindra, afangaro tsara ary tehirizo amin'ny -20 ℃.Ny fotoana fitehirizana maharitra dia miovaova amin'ny santionan'ny zavamaniry sy ny fanjakana.
Reaction System
| ddH2O | Ny 20,0 µl | Ny 50,0 µl |
| 2 × Plant Direct Master Mixa | 10,0 µl | 25.0 µ |
| Primer 1 (10 µM) | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Primer 2 (10 µM)b | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Santionan'ny ravin-javamaniry/nalaina an-keriny(Jereo ny fanodinana santionany) | 0,5 – 3 mm ravina disc/x µl | 0,5 – 3 mm ravina disc/x µl |
a.Misy Mg2+amin'ny fifantohana farany amin'ny 2 mM.
b.Amporisihina ny hampiasa ny fifantohana farany amin'ny 0.4μM isaky ny primer.Ny fampiasana tafahoatra ny primers dia hitarika amin'ny fitomboan'ny fanamafisana tsy voafaritra.
c.Ny habetsahan'ny santionany ampiasaina dia azo ahitsy araka ny zava-misy marina.Ny vola ampiasaina amin'ny fanehoan-kevitra tokana amin'ny santionany lysed crude dia azo ovaina eo anelanelan'ny 2% - 20% amin'ny totalin'ny fihetsiketsehana.Ny fampiasana santionany be loatra dia mety hiteraka tsy fahombiazan'ny amplification.
Fandaharana fanehoan-kevitra
| DINGANA | hafanana | Time |
| Denaturation voalohany | 98 ℃ | 5 min |
| Denaturation | 95 ℃ | 10 seg |
| Fanafody | 58 ~ 72 ℃ | 15 seg |
| Fanitarana | 72 ℃ | 30 seg |
| Fanitarana farany | 72 ℃ | 5 min |
a.Ny dénaturation voalohany (98 ℃, 5 min) dia mampiroborobo ny lysis ny tavy zavamaniry, mamoaka ADN génomika azo ampiasaina amin'ny fanamafisana PCR.Aza manafohy ny fotoana na mampihena ny mari-pana.
b.Amporisihina ny hametraka izany mitovy amin'ny sanda Tm primer na 2 ~ 4 ℃ ambony noho ny sanda Tm.Ny polymerase ADN fanamafisana mivantana ampiasaina amin'ity vokatra ity dia tsy mitovy amin'ny polymerase Taq ADN mahazatra, ary manana fepetra manokana ho an'ny mari-pana fanalefahana ny fihetseham-po; ny fampiasana ny mari-pana annealing avo dia mety hampihena ny fanamafisana tsy voafaritra ary hanatsara ny fahombiazan'ny fanamafisana.Ho an'ny maodely sarotra, ny fanamafisam-peo mahomby dia azo atao amin'ny alàlan'ny fanitsiana ny mari-pana annealing sy ny fanitarana ny fotoana.
c.Raha ≤1 kb ny halavan'ny vokatra fanamafisam-peo, ny fotoana fanitarana dia napetraka amin'ny 30 sec/kb;raha > 1 kb ny halavan'ny vokatra fanamafisam-peo, dia 60 sec/kb ny fotoana fanitarana.
d.Ho an'ny santionany sarotra na santionany miaraka amin'ny vokatra amplification ambany, ny isan'ny tsingerina dia azo ampitomboina araka ny tokony ho izy ho 40 -50 cycles.
Applications
Izy io dia azo ampiharina amin'ny fanamafisana mivantana ny tadin'ny zavamaniry sy ny fitiliana avo lenta amin'ny santionan'ny zavamaniry izay tsy misy polysaccharides sy polyphenols.
-tsoratra
Ho an'ny fampiasana fikarohana ihany.Tsy ampiasaina amin'ny fomba diagnostika.
1. Ho an'ny fanamafisana ny zava-maniry maloto na ny fanamafisana mivantana, dia asaina mampiasa ADN génomika voadio ho fanaraha-maso tsara alohan'ny hanombohan'ny fanandramana mba hahazoana antoka fa marina ny rafitra, ny voalohany ary ny fiasa.
2. Ny polymerase ADN fanamafisana mivantana ampiasaina amin'ity kitapo ity dia manana asa fanaraha-maso matanjaka.Raha mila atao ny kloning TA, dia asaina manadio ny ADN alohan'ny hampidirana ny adenine.
3. Torolàlana momba ny famolavolana voalohany:
a.Amporisihina fa ny fototra farany amin'ny faran'ny 3′ amin'ny primer dia tokony ho G na C.
b.Tokony hohalavirina ny tsy fifankahazoana misesy ao amin'ny toby 8 farany amin'ny faran'ny 3′ amin'ny primer.c.Halaviro ny firafitry ny volo eo amin'ny faran'ny 3′ amin'ny primer.
d.Tsy tokony hihoatra ny 1 ℃ ny tsy fitovian'ny sandan'ny Tm an'ny primer mandroso sy ny primer mivadika ary ny sanda Tm dia tokony ho 60 ~ 72 ℃ (Primer Premier 5 no soso-kevitra hanisa ny sanda Tm).
e.Ny filaharana fototra fanampiny fanampiny izay tsy mifanaraka amin'ny môdely, dia tsy tokony hampidirina rehefa kajy ny sanda Tm voalohany.
f.Manoro hevitra fa ny votoatin'ny GC amin'ny primer dia 40% -60%.
g.Ny fizarana ankapobeny ny A, G, C ary T ao amin'ny primer dia tokony ho araka izay azo atao.Fadio ny mampiasa faritra be GC na AT.
h.Halaviro ny fisian'ny filaharana mifameno amin'ny fototra 5 na mihoatra na ao anatin'ny primer na eo anelanelan'ny primer roa ary misoroka ny fisian'ny filaharana mifameno amin'ny fototra 3 na mihoatra amin'ny faran'ny 3′ amin'ny primer roa.
i.Ampiasao ny fiasa NCBI BLAST hanamarina ny maha-tokana ny primer mba hisorohana ny fanamafisana tsy voafaritra.
