Uracil ADN Glycosylase
Uracil-DNA Glycosylase (UNG na UDG) dia clone recombinant an'ny E.coli miaraka amin'ny lanjan'ny molekiola 25 kDa.Mampihena ny famotsorana ny uracil maimaim-poana avy amin'ny ADN misy uracil tokana sy roa sosona izy io, ary tsy mavitrika amin'ny ARN, ary azo ampiasaina mba hisorohana ny fandotoana ny vokatra fanamafisam-peo PCR.Ny fitsipiky ny hetsika dia mifototra amin'ny zava-misy fa raha ny dUTP dia soloina amin'ny dTTP amin'ny PCR fanehoan-kevitra ary ny vokatra fanamafisam-peo PCR misy base dU dia miforona, ny enzyme dia afaka manapaka ny fatorana glycosidic amin'ny base U amin'ny tady tokana sy roa. ADN ary manimba ny vokatra fanamafisam-peo PCR.
Fampiharana soso-kevitra
Fanamafisana ny fisorohana ny loto
Toetra fitahirizana
-20°C ho an'ny fitehirizana maharitra, tokony afangaro tsara alohan'ny fampiasana, fadio ny fanala matetika.
fitahirizana buffer
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Stabilizer, 50% Glycerol.
Famaritana vondrona
Ny habetsahan'ny anzima ilaina amin'ny fanimbana 1µg amin'ny ADN tady tokana misy fototra dU ao anatin'ny adiny iray amin'ny 37°C dia 1 isa.
Fanaraha-maso kalitao
1.SDS-PAGE electrophoretic fahadiovana mihoatra ny 98%
2.Fanamafisana fahatsapana, batch-to-batch fanaraha-maso, fahamarinan-toerana
3.Aorian'ny fikarakarana ny 1U an'ny UNG amin'ny 50 ℃ mandritra ny 2 minitra, ny môdely misy U eo ambanin'ny 103 dika mitovy dia tokony ho simba tanteraka ary tsy misy vokatra fanamafisam-peo azo vokarina.
4.Tsy misy hetsika nokleary exogenous
torolalana
| singa | Vola (μL) | fifantohana farany |
| 10 × PCR Buffer (tsy misy dNTP, Mg²+maimaim-poana) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (soloina dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1.25 U |
| 5 U/μL UNG | 0.25 (0.1-0.5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Fangaro voalohanyny | 2 | 1× |
| Endrika | - | <1μg/fihetsika |
| ddH₂O | To 50 | - |
Fanamarihana: a: Raha ampiasaina amin'ny qPCR/qRT-PCR, dia tokony hampidirina ao amin'ny rafitra fanehoan-kevitra ny probe fluorescent.Matetika, ny fifantohana primer farany amin'ny 0,2 μM dia afaka manome vokatra tsara;rehefa mahantra ny fanehoan-kevitra, dia azo ahitsy ny fifantohana voalohany amin'ny 0.2-1 μM.Amin'ny ankapobeny, ny fifantohan'ny probe dia tsara indrindra amin'ny 0.1-0.3 μM.Ny andrana gradient concentration dia azo atao mba hahitana ny fitambaran'ny primer sy probe tsara indrindra.
-tsoratra
1.Ny enzyme UNG dia azo ampiasaina hanesorana ireo vokatra fanamafisam-peo dUTP voapoizina amin'ny rafitra fanehoan-kevitra alohan'ny fihetsiketsehan'ny PCR, avy eo mba hisorohana ny vokatra diso noho ny fandotoana ny vokatra.
2.Ny mari-pana tsara indrindra ho an'ny enzyme UNG ampiasaina amin'ny fanehoan-kevitra PCR manohitra ny fandotoana dia amin'ny ankapobeny 50 ℃ mandritra ny 2mins;ny toe-javatra tsy mihetsika dia 95 ℃ mandritra ny 5mins.
3.Ialao ny fanalefahana matetika, ary aza avela hiovaova be ny mari-pana.
4.Ny fototarazo samihafa ampitomboina dia manana fahombiazan'ny fampiasana ny dUTP sy ny fahatsapana ho an'ny enzyme UNG, noho izany, raha ny fampiasana ny rafitra UNG dia mitarika ho amin'ny fihenan'ny fahatsapan'ny fahitana, ny rafitra fanehoan-kevitra dia tokony ahitsy sy amboarina, raha mila fanohanana ara-teknika ianao, azafady mifandraisa ny orinasanay.
